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慢病毒载体

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慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒可将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。

　　慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂（图1）。

 

　　图1 慢病毒包装和侵染细胞的过程

　　慢病毒载体具有宿主范围广，免疫原性低，基因容量大，可以长期表达等特点。能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。

　　慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，达到持久性表达，因而可构建稳定细胞株，用于基因的细胞功能研究。借助慢病毒载体改造T细胞可用于CAR-T细胞治疗。

 

 

慢病毒包装与纯化

　　慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装，收集细胞培养上清，通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。

 

慢病毒滴度检测

　　检测方法：定量PCR检测感染后细胞基因组中外源DNA拷贝数

　　

　　实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组

 

慢病毒载体优势

① 表达时间长：慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上，实现基因长时间稳定的表达，不随细胞分裂传代而丢失，是细胞实验的首选，常用于构建稳定株。
② 安全性高：未发现致病性，慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T细胞治疗。
③ 免疫原性低：直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验。

不同病毒的生物学特性比较

 

载体选择
　　煊晟兴成生物拥有丰富的慢病毒产品，用于操作编码基因和非编码基因，如lncRNA、microRNA、circRNA，如下慢病毒载体可供您选择（不限于此列表）：

调控方式

载体名称（载体元件顺序）

真核抗性

荧光

启动子

默认标签

载体容量

  过表达

pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE

N/A

EGFP

CMV

3FLAG

4.8kb

pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE

N/A

EGFP

CMV

N/A

4.4kb

pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-WPRE

N/A

mCherry

CMV

3FLAG

4.8kb

pSLenti-CMV-MCS-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE

Puro

N/A

CMV

3FLAG

4.4kb

pSLenti-SFH-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE

Puro

EGFP

CMV

3FLAG

3.5kb

pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE

Puro

EGFP

CMV

3FLAG

3.7kb

pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE

Puro

EGFP

CMV

N/A

3.8kb

pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE

blasticidin

EGFP

CMV

N/A

3.9kb

pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE

Puro

EGFP

CMV

3FLAG

3.7kb

pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS

Puro

EGFP

CMV

N/A

3.7kb

pSLenti-EF1-mCherry-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE

Puro

mCherry

CMV

3FLAG

3.7kb

pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE

Puro

mCherry

CMV

3FLAG

3.7kb

pSLenti-EF1-mCherry-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS

Puro

mCherry

CMV

N/A

3.7kb

pLenti-CMV-Luc2-IRES-Puro-WPRE

Puro

N/A

CMV

N/A

2.2kb

pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE

Puro

N/A

CMV

N/A

2.8kb

 表达cre

pLenti-CMV-NLS-Cre-3xFLAG-WPRE

N/A

N/A

CMV

3FLAG

3.9kb

pLenti-CMV-DIO-MCS-WPRE

N/A

N/A

CMV

3FLAG

5.3kb

三标

pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-Puro-WPRE

Puro

mNeonGreen

CBh

3FLAG

1.3kb

pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-Puro-WPRE

Puro

tdTomato

CBh

3FLAG

0.6kb

pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-BSR-WPRE

blasticidin

mNeonGreen

CBh

3FLAG

1.5kb

pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-BSR-WPRE

blasticidin

tdTomato

CBh

3FLAG

0.8kb

circRNA过表达

pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-S-circRNA-WPRE

N/A

EGFP

CMV

N/A

3.0kb

pLenti-CMV-S-circRNA-WPRE

N/A

N/A

CMV

N/A

4.8kb

pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-L-circRNA-WPRE

Puro

EGFP

CMV

N/A

1.0kb

pLenti-CMV-L-circRNA-WPRE

N/A

N/A

CMV

N/A

2.8kb

miRNA过表达

pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE

Puro

EGFP

CMV

N/A

N/A

pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE

Puro

EGFP

U6

N/A

N/A

pLenti-CMV-TurboGFP-IRES-Puro-miR30(miRNA)-WPRE

Puro

TurboGFP

CMV

N/A

N/A

pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE

Puro

mCherry

U6

N/A

N/A

pCLenti-EF1-Puro-CMV-EGFP-3xFLAG-Sponge(miRNA)-WPRE

Puro

EGFP

CMV

3FLAG

N/A

pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-BSR-WPRE

blasticidin

EGFP

CMV

N/A

N/A

pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE

Puro

EGFP

CMV

N/A

N/A

过表达（Tet-on）

pLenti-TRE-EGFP-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE

Puro

EGFP

TRE

N/A

2.0kb

pLenti-TRE-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE

Puro

EGFP

TRE

3FLAG

3.3kb

pLenti-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE

Puro

N/A

EF1

N/A

N/A

shRNA干扰

pCLenti-U6-shRNA-CMV-Puro-WPRE

Puro

N/A

U6

N/A

N/A

pCLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-WPRE

N/A

EGFP

U6

N/A

N/A

pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE

Puro

EGFP

U6

N/A

N/A

pSLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE

Puro

mCherry

U6

N/A

N/A

pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-BSR-WPRE

blasticidin

mCherry

U7

N/A

N/A

CRISPR敲除

pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE

Puro

N/A

U6

N/A

N/A

pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-BSR-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE

blasticidin

N/A

U6

N/A

N/A

pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE

N/A

sfGFP

U6

N/A

N/A

pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE

N/A

EGFP

U7

N/A

N/A

pLenti-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-espCas9_1.1-WPRE

Puro

N/A

CMV

3FLAG

N/A

CRISPRa转录激活

pCLenti-U6-gRNA-MS2-EFS-dCas9-VP64-T2A-BSD-WPRE

blasticidin

N/A

U6

N/A

N/A

pCLenti-EF1a-MCP-P65-HSF1-T2A-Hygro-WPRE

hygromycin

N/A

EF1a

N/A

N/A

pCLenti-U6-gRNA-2x(wt+f6)MS2-CMV-MCP-P65-HSF1-IRES-BSR-WPRE

blasticidin

N/A

U6/CMV

N/A

N/A

pLenti-CMV-dCas9-VP64-T2A-Puro-WPRE

Puro

N/A

CMV

N/A

N/A

 

常规应用

　　体外感染细胞

　　

　　慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。

　　

　　慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，因而可以达到持久性表达，从而构建稳转细胞株，体外进行细胞功能学实验，包括细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等研究。稳定表达目的基因的肿瘤细胞株还可以进一步构建肿瘤动物模型，进行体内基因功能验证，药效药代，活体成像等检测，进一步研究体内肿瘤发生、发展和转移及药物治疗的效果。
 



　　常见MOI列表

细胞名

中文名称

慢病毒感染MOI
（参考值）

MGC80-3

人胃癌细胞

10

HT-29

人结肠癌细胞

20

RKO

人结肠腺癌细胞

10

Caki-1

人肾透明细胞癌皮肤转移细胞

10

5637

人膀胱癌细胞

10

U-118 MG

人脑星形胶质母细胞瘤

10

RWPE-1

人正常前列腺上皮细胞

20

HeLa

人宫颈癌细胞

10~20

Ca Ski

人宫颈癌肠转移细胞

10

MCF7 [MCF-7]

人乳腺癌细胞

10

A549

人非小细胞肺癌细胞

10

NCI-H1299

人非小细胞肺癌细胞

20

U-87 MG

人脑星形胶质母细胞瘤

10

U251

人胶质瘤细胞

10

A172

人胶质母细胞瘤细胞

10

K-562

人慢性髓原白血病细胞

10

HL-60

人原髓细胞白血病细胞

10

GES-1

人胃上皮细胞

20

U266

人骨髓瘤细胞

20

CAL 27

人舌鳞癌细胞

20

PC9

人肺癌细胞

5

PC14

人肺癌细胞

10

MADB-106

大鼠乳腺癌细胞

20

F98

大鼠脑胶质瘤细胞

20

MHCC-97H

人肝癌细胞（高转移）

10~20

 

　
　　MOI 是multiplicity of infection 的缩写，即感染复数，其含义是感染时病毒与细胞的数量比值，一般以实验中某个细胞，感染达到80%，定义为这个细胞的MOI值，即病毒量与细胞数的比值；加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000

 

慢病毒在肿瘤研究中的应用案例
 
[慢病毒, 胶质细胞瘤]
慢病毒干扰： Lenti-shNT/shPTN/shPTPRZ1

 

2.  [慢病毒, 肝癌]
慢病毒过表达/干扰：pLV-CMV-PGK-EGFP-T2A-puro/ pLV-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-puro

 

 
慢病毒在神经系统的应用（在体注射）
1． [慢病毒, 学习与记忆]

 

病毒类型：慢病毒
载体名称：LV-Suv39h1-RNAi（不确定详细的）
注射部位：海马DG区
病毒注射量：2 μL，9.98 × 108 TU/mL
检测时间：2周
 
2． [慢病毒, 神经环路]

 

病毒类型：慢病毒
载体名称：LV- CX36-shRNA-EGFP（不确定详细的）
注射部位：P1小鼠新皮层L1
病毒注射量：1μL
检测时间：2周
3． [慢病毒, 自闭症]
 

 

病毒类型：慢病毒
载体名称：Lenti-CMV-EGFP-P2A-3FLAG-Rac1
注射部位：小鼠海马CA1区
病毒注射量：1μL
检测时间：4周
 
慢病毒延伸服务

 

 
煊晟兴成生物慢病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采用三质粒或四质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。一般情况下我们的慢病毒的滴度在108~109TU/ml，完全可以满足各类实验的使用要求。